中华医学杂志, 2022,102(10) : 735-740. DOI：10.3760/cma.j.cn112137-20210621-01395本文引用：张冬梅, 翟翠静, 冯向东, 等. GATA3、SOX10及p16联合应用在三阴性乳腺癌诊断中的价值 [J] .
摘要目的 探讨GATA3、SOX10和p16在三阴性乳腺癌（TNBC）中的表达，并分析其意义及与临床病理之间相关性。 方法 采用免疫组化EnVision法检测53例（病例来自2018年3月至2021年3月，33例来自首都医科大学附属复兴医院，20例来自浙江省绍兴市人民医院病理）TNBC［均为女性，平均年龄56.9（29~82）岁］及50例非TNBC［均为女性，平均年龄65.3（40~82）岁］组织中GATA3、SOX10及p16的表达。探讨这3种抗体的表达对TNBC的诊断价值。 结果 TNBC中GATA3和SOX10阳性率分别为58.5%（31/53）和75.5%（40/53）。TNBC患者组织中SOX10阳性率明显高于非TNBC患者（ P <0.05）。22例GATA3阴性表达的TNBC病例中，有17例SOX10阳性（77.3%）。TNBC中p16表达41.5%（22/53）明显高于非TNBC 4%（2/50），且与SOX10共表达率明显增加（ P <0.05）。SOX10的敏感度、特异度及受试者工作特征（ROC）曲线下的面积（AUC）大于GATA3，SOX10的敏感度高于p16，但特异度略低于p16，SOX10的AUC大于p16。GATA3与SOX10联合应用及SOX10与p16联合应用时的AUC均高于二者单独应用时（ P <0.05）。GATA3、SOX10及p16的表达与患者年龄、肿瘤大小及淋巴结转移均无明显相关性。组织学3级及基底样型TNBC中SOX10的表达率明显增加，p16在基底样型TNBC中阳性率也明显增加，二者的共表达率增加。 结论 SOX10与p16在TNBC中表达率明显增加，SOX10是诊断TNBC的可靠标志物，是对GATA3的补充。p16是否为与TNBC预后有关的标记物有待于进一步研究。
三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一种相对较少的乳腺癌亚型，约占所有乳腺癌病例的15%，以雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）表达缺乏为特征。在最近的研究中，GATA3在90%以上的乳腺癌中有表达。基于其高敏感性，特别是在ER+乳腺癌中被常规用作乳腺起源的标志。然而，GATA3在ER阴性乳腺癌中阳性率较低，尤其是TNBC，据报道其阳性率为20%~60% ［1］，并且由于其在其他部位的多种癌症中的表达而相对缺乏特异性，包括唾液腺、皮肤附属器、胰腺、肝脏、子宫内膜和尿路上皮等部位发生的癌。与GATA3相比，SOX10目前被认为在TNBC中具有更高的灵敏度，并且与来自其他部位的癌的交叉反应程度较低［2］。文献报道，SOX10是一种在TNBC和化生性乳腺癌中优先表达的转录因子，可调节乳腺上皮细胞的干/祖细胞和间充质细胞态势［3］。p16是一种肿瘤抑制蛋白和细胞周期调节蛋白。p16突变在乳腺癌中的潜在预后价值已经被广泛研究，但是其在TNBC表达中的作用尚未完全了解。因此，本研究旨在评估TNBC中GATA3、SOX10及 p16表达情况及与各种临床参数的关系，寻找可靠的肿瘤标志物。
01对象与方法
1. 临床资料：收集首都医科大学附属复兴医院病理科以及浙江省绍兴市人民医院病理科2018年1月至2021年3月通过免疫组化和（或）荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）确定的TNBC 53例（复兴医院2例，绍兴市人民医院51例），非TNBC 50例（复兴医院40例，绍兴市人民医院10例）。全部病例由经验丰富的病理医师再次审核，将所得到的临床、病理及随访资料进行分析。
2. 研究方法：将乳腺癌的组织标本进行组织常规制片，切片4 μm厚。免疫组织化学采用EnVision法。一抗包括ER抗体（ER，克隆号SP1）、PR抗体（PR，克隆号SP2）、HER-2抗体（克隆号MXR001）、细胞角蛋白5/6（CK5/6，克隆号MX040）、SOX10抗体（克隆号EP268）、GATA3抗体（克隆号L50-823）、p16抗体（克隆号MX007）。抗体均购自福州迈新生物技术开发有限公司。DAB显色按说明书操作。
3. 结果判定：所有苏木精伊红染色病理切片及免疫组化结果均由2名高年资病理医师进行双盲病理阅片。组织学根据Nottingham组织学分级评价系统 ［4］ 进行分级。ER/PR判断标准依据2010年美国临床肿瘤学会/美国病理医师学院（ASCO/CAP）判断标准。如果肿瘤细胞核着色率为1%~100%，则认为ER或PR阳性。HER-2判断标准依据2019版《乳腺癌HER-2检测指南》。0~1+表示阴性，3+表示阳性，2+则进行FISH检测，如HER-2基因无扩增则为阴性。GATA3、SOX10及p16免疫组化学染色至少有1%的肿瘤细胞染色被认为是阳性。
4. 统计学处理：所有实验数据均采用SPSS 20.0统计分析软件进行分析。符合正态分布的定量资料采用
的方式表示，不符合正态分布的定量资料采用M（Q1，Q3），计数资料以例（%）情势表示。组间比较采用χ²检验或单因素方差分析，采用双侧检验，检验水准α=0.05。通过Spearman相关性来确定TNBC中各免疫组化表达与临床病理之间的相关性。采用Medcalc20.0.9软件绘制受试者工作特征（ROC）曲线，计算ROC曲线下面积（AUC）及其95%可信区间（CI），评估各抗体对TNBC的诊断的敏感度和特异度，并比较ROC曲线下面积AUC。
02结果
1. 一般临床病理特点：纳入TNBC 53例，全部为女性，平均年龄为56.9岁（29~82岁），肿瘤大小平均2.35（1.0~5.5）cm，组织学分型包括浸润性导管癌 52例，浸润性小叶癌1例。浸润性导管癌中组织学3级共33例（63.5%），2级19例（36.5%）。非TNBC 50例，均为女性患者，年龄平均为65.3岁（40~82岁），肿瘤大小平均1.75（0.5~3.0）cm，组织学分级包括3级17例（34.0%），2级33例（66.0%）。
2. 免疫组织化学特征：GATA3在非TNBC中阳性率明显低于TNBC组（58.5%与92.0%， P <0.05）。而TNBC中SOX10阳性率（75.5%）及p16阳性率（41.5%）明显高于非TNBC组（分别为6.0%及4.0%， P <0.05）。值得关注的是，22例GATA3阴性TNBC病例中有17例表达SOX10（77.3%）。TNBC中SOX10与p16共表达率明显高于非TNBC组（42.5%与0， P <0.05），差异有统计学意义（图1，表1）。
图1 1例三阴性乳腺癌组织中GATA3、SOX10及p16的表达情况 A：为非三阴性乳腺癌组织对照。HE染色，×20；B：为GATA3呈灶性中等强度着色，免疫组织化学染色；C：SOX10呈弥漫强阳性，免疫组织化学染色；D：p16呈灶性中等强度着色。EnVision法 ×20
TNBC中，组织学3级共33例，与2级相比，SOX10的表达率增加（84.8%与63.2%），而GATA3的表达率降低（51.5%与68.4%），但二者的组间差异无统计学意义（ P >0.05）。p16在两组间的阳性率无明显变化（45.5%与36.8%），但p16和SOX10在3级中的共表达明显高于2级中的共表达（42.4%与15.8%， P <0.05）。
按照CK5/6免疫染色将TBNC分为基底样型（ n =26，50.0%）和非基底样型（ n =26，50.0%）。再次分析两种亚型之间SOX10、GATA3和p16的表达。GATA3在基底样型中的阳性表达率明显低于非基底样型（38.5%与76.9%），而SOX10和p16在基底样型中的阳性表达率明显高于非基底样型（分别为88.5%与65.4%，50.0%与23.1%）。二者差异均有统计学意义（ P <0.05）。SOX10与p16在基底样型中的共表达率也明显高于非基底样型（50.0%与7.7%， P <0.05）（表2）。
3. GATA3、SOX10与p16诊断TNBC的灵敏感及特异度：在确定TNBC与非TNBC时，SOX10的敏感度及特异度大于GATA3，SOX10的AUC大于GATA3，二者差异具有统计学意义（0.847与0.668，P<0.05）。二者联合应用的敏感度高于二者单独应用，但特异度低于二者单独应用。联合应用的AUC（0.886）也明显高于二者单独应用时的AUC（P<0.05）。SOX10的敏感度高于p16，但特异度低于p16，SOX10的AUC高于p16的 AUC（0.847与0.688，P<0.05）。二者联合应用的敏感度高于二者单独应用，但特异度低于二者联合应用，联合应用的AUC（0.896）高于二者单独应用（P<0.05）（图2，表3）。
4. TNBC中SOX10及p16表达与临床病理特征的关系：TNBC中，SOX10以及p16阳性患者首次就诊时的年龄及肿瘤大小均小于阴性患者，但二者之间无明显相关性。SOX10以及p16的表达与患者淋巴结转移亦无明显相关性（P>0.05）。GATA3似乎与较低的组织学分级相关，而SOX10相反，但均无明显的相关性。GATA3与基底样型表达呈负相关（P=0.033），而SOX10与基底样型表达呈正相关（P=0.040）（表4）。
03讨论 TNBC是一种具有高侵袭性、转移风险较高的肿瘤，除ER、PR、HER-2均表达缺失外，GATA3及GCDFP15 等常见的乳腺谱系标记物表达也较低。SOX10属于SOX基因家族，位于人类性染色体的性别决定区SRY（sex determiningregion-Y）区域，其特点是具有一个高迁移率（high mobility group，HMG）盒DNA 结合域。SOX10是神经嵴分化的特征标记，也被认为是神经嵴干细胞标记物。可介导神经嵴细胞向黑色素细胞、少突胶质细胞和胶质细胞的分化，并有助于干细胞/祖细胞活化，诱导乳腺细胞的间充质转化 ［5］。据报道，乳腺癌中，66%的TNBC和化生性癌中有SOX10阳性表达，但只有5%的非TNBC阳性［6］。本研究结果表明，与非TNBC相比，TNBC中GATA3表达率明显降低而SOX10表达率明显增加。SOX10的敏感度、特异度及AUC均高于GATA3，说明SOX10在TNBC中的诊断价值更高。组织学级别越高，SOX10阳性率也越高。有文献提出SOX10阳性与阴性患者之间的肿瘤大小存在统计学差异［7］，本研究未发现这种差异，可能与病例数较少有关。TNBC可根据其基因表达谱进一步分为不同的分子亚型，包括基底样型、免疫调节、间充质样细胞、间充质样干细胞、管样雄激素受体和不稳定型 ［8］。其中，基底样型TNBC是最常见的。免疫组化方面，该亚型除ER、PR和HER-2表达缺失外还表达CK5/6或EGFR。与其他亚型的TNBC相比，基底样型预后较差。本研究与文献报道［9］基本一致，SOX10在CK5/6染色阳性的基底样型TNBC中阳性率更高。Harbhajanka等［5］的研究中，60%的基底样型TNBC表达SOX10，故SOX10的免疫反应可能有助于支持三阴性、基底样型转移瘤的乳腺起源。Sejben等［10］的研究证明，SOX10是表达CK5的TNBC中最敏感的乳腺标记物，可能对应于免疫组化分类基础上的基底样型TNBC。Jamidi等［1］的研究中，SOX10与TNBC的基底样型标志物、患者年龄更小、组织学分级更高呈正相关。本研究只发现SOX10表达与基底样型呈正相关，而与患者年龄及组织学分级等无明显相关性，这可能需要更大的样本样来验证这种相关性。GATA3及SOX10在转移性TNBC的诊断中也有辅助作用。虽然GATA3比SOX10更加敏感，但SOX10在大多数GATA3阴性的乳腺转移性癌中呈阳性，本研究中22例GATA3阴性的TNBC中有17例表达SOX10，阳性率高达77.3%。因此针对ER、PR和HER-2阴性表达的转移瘤，建议同时使用GATA3和SOX10来证实是否为乳腺起源的肿瘤。p16是一种肿瘤抑制蛋白和细胞周期调节蛋白，通过阻止视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）基因的磷酸化而抑制细胞周期G1期的进程。p16失活被认为是多种肿瘤发展过程中的关键事件，如女性生殖系统肿瘤，淋巴瘤，颅内恶性肿瘤等。Hashmi等 ［11］的研究结果显示，71%的TNBC具有p16阳性表达。结果表明，与非TNBC相比，TNBC更频繁地表达p16（41.51%）。本研究还视察到，在基底样型TNBC中p16阳性染色更为常见，但二者之间无统计学意义。Abou-Bakr和Eldweny［12］的研究显示，与非基底样型TNBC相比，基底样型中p16呈高表达（分别为80.0%和50.8%）。一项包含60例TNBC病例的研究显示，p16阳性肿瘤的ki67指数都很高。由于高ki67指数是乳腺癌的一个明确预后不良的因素，因此他们认为p16在乳腺癌中具有潜在的预后价值［13］。然而，另一项研究表明，p16阳性与治疗反应良好相关，无病生存率及总体生存率显著增加［14］。本研究中p16表达病例具有患者年龄偏低、肿瘤偏小的趋势，但是无明显相关性；然而p16与SOX10的共表达率明显增加，二者联合应用的AUC均高于单独应用。关于p16与TNBC预后之间的关系，仍需更多研究来证实。本研究评估了GATA3、SOX10及p16在TNBC中的表达情况。SOX10及p16在TNBC中表达明显增加，尤其是在基底样型TNBC中。但是GATA3和SOX10都不能100%的检测所有的TNBC。由于SOX10可表达于GATA3阴性的病例中，因此二者在检测TNBC时可以互补。p16在TNBC中的高表达提示该生物标志物在TNBC发病机制及预后中的可能具有一定的作用，需要进行更深入的分子学研究。